測(cè)序儀進(jìn)行pcr測(cè)序反應(yīng)的操作步驟
測(cè)序儀進(jìn)行pcr測(cè)序反應(yīng)的操作步驟： (1) 取0.2ml的pcr管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測(cè)定模板管 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管
bigdye mix 1μl 1μl
待測(cè)的質(zhì)粒dna 1μl －
pgem-3zf (+) 雙鏈dna － 1μl
待測(cè)dna的正向引物 1μl －
m13(-21)引物 － 1μl
**去離子水 2μl 2μl
總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊pcr管，用手指彈管混勻，稍離心。
(2) 將pcr管置于9600或2400型pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98℃變性2min后進(jìn)行pcr循環(huán)，pcr循環(huán)參數(shù)為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
(3) 醋酸鈉/乙醇法純化pcr產(chǎn)物
(4) 電泳前測(cè)序pcr產(chǎn)物的處理
(5) 分析或打印出彩色測(cè)序圖譜
(6) 序列分析：儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知，可通過序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率
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